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聚(MMA-co-EDMA)阳离子交换整体柱的

杨更亮1,2*,白立改1,2

1: 河北省药物质量分析控制重点实验室;

2:河北大学药学院

摘要:本文通过原子转移活性可控自由基聚合方式制备了新型的多孔整体柱。其中以甲基丙烯酸甲酯为单体,FeCl2为催化剂,NaHSO3为无机添加剂以及联合CCl4作为二元引发剂来控制聚合过程中自由基的浓度及活性。本文对整体柱的内部形态、机械稳定性以及通透性等进行了表征。该整体柱表现了良好的色谱特征。因此,以该整体柱作为高效液相色谱的固定相并对鸡卵清中的溶菌酶进行了分离。该方法具有较高的分辨率和较好的重复性。

关键词:原子转移自由基聚合;甲基丙烯酸甲酯;阳离子交换;高效液相色谱(HPLC)

  1. 前言

用于色谱领域的聚合物常以原位自由基聚合方式得到。然而,通过原位自由基聚合得到的聚合物具有结构不均匀的缺点,这一结果归咎于聚合方式本身具有慢引发、快增长、易产生链转移和链终止的特点。

为了避免这一缺点,活性可控自由基聚合被引入到聚合物整体柱的制备中来[1-4]。活性可控自由基聚合方式制备得到的聚合物具有较为相近的分子量,较为均匀的结构[5-7]

本文中应用了活性可控自由基聚合方式中的原子转移自由基聚合方式[8],制备得到了聚合物整体柱。

  1. 实验部分

2.1试剂及仪器

溶菌酶购自Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA);十二醇购自中国医药有限公司(北京,中国);CCl4和FeCl2购自伊利有限责任公司(北京,中国);甲基丙烯酸甲酯(MMA)购自天津化学试剂有限公司(天津,中国)。乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)购自安新化学试剂有限公司(辽宁,中国)。所有上述试剂均为分析纯,实验中所用水均为超纯水。

安捷伦1100系列高效液相色谱仪(由四元泵、在线脱气机、自动进样器以及紫外检测器组成)(Agilent Technologies,美国);红外光谱仪 (IR) (FT-IR8400S, Shimadzu Co., 日本); 扫描电子显微镜 (SEC) (KYKY 1000B, 中国科学院科学仪器有限公司, 中国)。

  1.  整体柱Ma的制备

将0.5 mL MMA,0.3 mL EDMA,1.0 mL十二醇, 0.1 mL甲醇, 0.05 mL CCl4和 0.003 g FeCl2加入到一个干净的安瓿瓶中,然后加入事先以0.1mL水溶解的0.01g NaHSO3。然后超声脱气使其溶解并混匀。溶液澄清后,倾倒于一段封口的不锈钢色谱柱管(50 mm × 4.6 mm i.d.)中。然后将另一端封口,置于70 ℃水浴中,反应20小时。完成后将该整体柱连接于HPLC系统,以甲醇在线冲洗除去致孔剂及其他可溶性物质。

  1. 聚合物整体柱Ma的表征

2.3.1红外光谱特征

整体柱Ma的表面化学基团通过红外光谱仪测定。

2.3.2 内部形态结构特征

整体柱Ma的内部形态结构通过扫描电子显微镜测得。

2.3.3 整体柱Ma对蛋白的分离

从鸡卵清中分离溶菌酶:市售鲜鸡蛋一枚,取卵清以磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L, pH 7)稀释至50%(V/V)。然后匀浆并经4,500 r/min,4 ℃ 离心15分钟。取上清液为溶菌酶源。梯度洗脱条件为:前三分钟,水为流动相;3-6分钟,  Na2HPO4 水溶液 (0.025 mol L-1,pH = 10) 为流动相;6-10分钟 Na2HPO4 水溶液(0.05 mol L-1,pH = 10) 为流动相。

2.3.4 整体柱Ma上磺酸基团含量的测定

将整体柱研磨后分别取0.1 g左右并准确称重于三个烧杯中。烧杯中分别加入20 mL水并超声混匀。然后以1.0 mol/L NaOH溶液在25℃环境下分别滴定,以酚酞为指示剂。取三次滴定结果的平均值即为整体柱Ma的磺酸基含量,根据公式(1)计算可得。

          公式(1)

其中:V为滴定中消耗的NaOH标定液的体积(mL),C为标准液的浓度(mol/L),M为HSO3的摩尔质量(mol),W为样品的质量(g)。

2.3.5 整体柱对溶菌酶动态载样量的测定

为了得到整体柱对溶菌酶的动态载样量,本实验以前沿分析法进行了分析,以溶菌酶含量为2.0 mg/mL 的Na2HPO4(0.05 mol L−1,pH= 10)水溶液为流动相。根据公式(2)可计算得到载样量:

                 公式(2)               

其中,VHB (mL) 为IgG的半突破体积, V0 (mL)为整体柱Ma的死体积, c (mg/mL) 为流动相中IgG的浓度,m (g)为整体柱干燥后的质量。

  1. 结果与讨论

3.1 整体柱制备的影响因素

本文考察了影响整体柱制备的多种因素,包括:单体与交联剂的比例、温度等。结果表明,交联剂的比例越大,所得到的整体柱的孔径越小,而单体的比例越大,所得到的整体柱的机械性能则较差,因此本实验选用了机械性能及孔径均适中的单体MMA与交联剂EDMA的比例5︰3(V/V)。温度对于聚合过程的影响结果为:当温度低于55℃时,聚合不能发生。而随着温度的升高,聚合物的机械性能逐渐优化,孔径则逐渐变小,因此具有较高的背压。因此本实验选用了机械性能及孔径均适中的反应温度70℃。

3.2 整体柱的特征

3.2.1整体柱的内部形态结构

表1中列出了整体柱Ma, Mb 和 Mc的制备条件,其对应的内部形态结构图均通过扫描电子显微镜得到,如图1所示。由图可知,与Mb 相比,Ma具有较为均匀的结构,与Mc相比,Ma具有较为适中的孔径(1µm)。

3.2.2 整体柱Ma的机械稳定性及通透性能

图2表示了分别以甲醇(a)和水(b)分别为流动相时整体柱Ma的背压与流速的线性关系(ra = 0.9991, rb = 0.9990)。这一结果表明,随着流速的增大,整体柱的内部结构并未变形,具有良好的通透性和机械性能。

1 聚合条件

Table 1 The conditions of polymerization.

 

NO.

MMA

(mL)

EDMA

(mL)

NaHSO3

(g)

CCl4

(mL)

FeCl2

(g)

AIBN

(g)

Methanol

(mL)

Water

(mL)

Dodecyl

alcohol

(mL)

Isopropyl

alcohol

(mL)

Ma

0.5

0.3

0.01

0.05

0.003

-

0.1

0.1

1.0

-

Mb

0.5

0.3

-

-

-

0.005

0.1

0.1

1.0

-

Mc

0.5

0.3

0.01

0.05

0.003

-

0.1

0.1

-

1.0

 

 

   

1 整体柱的扫描电镜图

a:Ma; b:Mb;c:Mc

Fig. 1 Scanning electron microscopy of samples.

a: SEM of Ma; b: SEM of Mb; c: SEM of Mc.

3.2.3 整体柱Ma的红外光谱图

图3 表示了整体柱Ma的红外光谱图。由图可知:2990 cm-1 和 2950cm-1处的吸收峰表明了C-H键的伸缩振动。1725 cm-1 处的吸收来自于 C=O键的伸缩振动。1250 cm-1 和 1150 cm-1 处的吸收峰则表明了-HSO3的存在。这也说明,-HSO3被成功接枝到整体柱的表面。

2 背压与流速的关系图

a:甲醇为流动相;b:水为流动相

Fig. 2. Back-pressures of the polymeric monolith at different flow rates

a:methanol was used as the mobile phase; b: water was used as the mobile phase

3.2.4 整体柱Ma的磺酸基含量

根据2.3.4部分的实验过程及公式(1),整体柱Ma的磺酸基含量为0.29 mmol g-1

3 整体柱Ma的红外光谱图

Fig. 3 The FT-IR spectra of Ma

 

3.2.5 整体柱Ma的色谱特征

图4(a,b,c)为整体柱Ma,Mb 和 Mc分别对鸡卵清中的溶菌酶进行分离的色谱图。图4(a)中有三个色谱峰,其中第二个峰为溶菌酶。而图(b)中则只有一个色谱峰,表明整体柱Mb对鸡卵清中的溶菌酶没有分离能力。图(c)中虽然也有三个色谱峰,但很明显其分辨率和柱效均比图(a)差。

4 整体柱对鸡卵清中溶菌酶的色谱分离图

a: 整体柱Ma的色谱分离图;b: 整体柱Mb的色谱分离图;c: 整体柱Mc的色谱分离图

梯度条件:前三分钟,水为流动相;3-6分钟,  Na2HPO4 水溶液 (0.025 mol L-1,pH = 10) 为流动相;6-10分钟 Na2HPO4 水溶液(0.05 mol L-1,pH = 10) 为流动相。

Fig. 4 Separation of Lys from chicken egg white

a: Chromatogram by the Ma; B: Chromatogram by the Mb; c: Chromatogram by the Mc.

Chromatographic conditions: the prepared polymeric monoliths, 50 mm × 4.6 mm i.d., respectively; injection volume: 3.0 μL; flow rate: 1.0 mL min-1; the gradient: water for the first 3 min, 0.025 mol L-1 of  Na2HPO4 aqueous solution (pH = 10) for the next 3 min and 0.05 mol L-1 of Na2HPO4 aqueous solution (pH = 10) for the last 3 min.

这是因为:整体柱Ma和Mc均具有阳离子交换基团-HSO3。当流动相的pH值小于溶菌酶的等电点(11)时,溶菌酶带正电荷,此时可被整体柱上的-HSO3吸引,因此在梯度的前三分钟以水为流动相时,溶菌酶被保留在整体柱上。当流动相的pH值接近于溶菌酶的等电点时,溶菌酶几乎不带电荷,因此当流动相为Na2HPO4水溶液 (0.025 mol L-1, pH = 10)时,溶菌酶被洗脱。而由于整体柱Mc的孔结构不均匀以及孔径较小的缺点,因此其色谱分离性能比Ma差。

Ma表现了良好的稳定性。在本实验的条件下,其保留时间和峰面积的RSD 值分别为0.20% (n=11) 和0.98% (n=11)。

3.2.6 整体柱Ma对溶菌酶的动态载样量

根据2.3.5部分的实验及公式(2),整体柱Ma对溶菌酶的动态载样量为3.53 mg g-1

  1. 结论

本文通过原子转移自由基聚合方式制备了一种结构均匀的整体柱。通过在聚合溶液中加入NaHSO3,一步制备了阳离子交换整体柱。将该整体柱用作高效液相色谱的固定相,对鸡卵清中的溶菌酶进行了成功分离。结果表明,该整体柱具有背压低,机械性能好,稳定及重复性好且具有良好的色谱性能等特点。该方法是一种简便、高效的制备聚合物整体柱并用于蛋白分离的方法。

参考文献

[1] Zhang RY, Qi L. Polymer, 2010,51(8): 1703~1708

[2] Bai LG, Liu HY. J. Chromatogr. A,2011, 1218(1), 100~106

[3] McCarthy P, Chattopadhyay M. Anal. Biochem., 2007, 366(1): 1~8

[4] H. Wang, X. Dong and M.Yang, Trac Trend Anal. Chem., 2012, 31: 96~108

[5] Kato M, Kamigaito M. Macromolecules, 1995, 28: 1721~1723

[6] Qin DQ, Qin SH. Polymer, 2000, 41(20), 7347 ~7353

[7] Cheng ZP, Zhu XL. Radiat. Phys.Chem., 2005, 72(6): 695~701

[8] Wang JS, Matyjaszewski K. J. Amer. Chem. Soc., 1995, 117(20):5614~5615

[9] Yılmaz M, Bayramoğlu G. Food Chem., 2005, 89(1): 11 ~18



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