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高效液相色谱-电化学检测法测定血浆中神经递质的研究

陈雯 沈钧 陈利琴 桑仲娜 赵越 张琪 任大林 张万起

天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生系,天津,300070

摘  要: 采用高效液相色谱-电化学检测法测定亚临床甲状腺功能减退和甲状腺功能减退病人血浆中神经递质含量,包括去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺(DA)、5羟色胺(5-HT)、5羟吲哚乙酸(5-HAA),了解亚临床甲状腺功能减退和甲状腺功能减退的病人血浆中神经递质含量的变化,研究神经递质变化与亚临床甲状腺功能减退疾病发病机制的关系。实验采用了C18柱,流动相采用的溶液为:V(0.035mol/L柠檬酸,0.045mol/L磷酸二氢钠,0.25mmol/L乙二胺四乙酸二钠,0.002mol/L庚烷磺酸钠):V(乙腈)=95:5,血浆样品采用80%三氯乙酸处理,12000r/min离心5min,以0.22μm滤膜过滤,进样50μl。结果显示各物质达到基线分离,保留时间稳定,分离效果良好。

关键词:高效液相色谱法;神经递质;血浆

 

1  引  言

神经递质又名神经介质在神经信息的传导中发挥着重要作用,在神经系统中目前较公认的神经递质主要分为乙酸胆碱类(Ach)、单胺类等[1]。单胺类神经递质是一类包含一个胺基的神经类物质,主要包括儿茶酚胺类和5-羟色胺类神经递质,在中枢神经系统中起重要作用,是机体内的重要神经递质。生物体内神经递质含量的改变与一系列生理和疾病状态密切相关。

目前报道的与下丘脑-垂体-甲状腺轴相关的主要的5-羟色胺(5-hydroxy tryptophan, 5-HT)、去甲肾上腺素(norepinephrine, NE) 和多巴胺(dopamine, DA), 其中5-HT系统是目前与甲状腺轴关系最为密切[2,3],报道最多的神经递质,其主要代谢产物5羟吲哚乙酸(5-HIAA)也是反映5-HT在外周系统转换的主要指标,同时也作为反映血清素能性功能的一个指标。由于单胺类神经递质在人脑组织和体液中的含量较低,并且单胺类神经递质中儿茶酚胺类与络氨酸结果相似,只有足够的灵敏检测方法才能同时达到分离和同时检测的目的。高效液相色谱法因其具有高分离能力,并且检测简便易行,在单胺类神经递质中应用广泛,是目前研究最多的单胺类神经递质检测技术[4]。用于液相色谱的检测器有很多,其中常见的有紫外-可见光检测器、荧光检测器、以及电化学检测器等,其中电化学检测器具有高选择性、高灵敏度的特点,非常适合用于单胺类神经递质的分析,国内外的研究广泛报道了高效液相—电化学检测法在生物样品中神经递质检测中的应用[5,6]。因此本研究采用高效液相—电化学检测法测定血浆中的神经递质,实验结果证明此法操作简单,灵敏度高。

 

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

Waters 600 型高效液相色谱仪,Waters717 自动进样装置,Waters 2465电化学检测器,Empower色谱工作站(均为美国waters公司);C18柱(上海济成分析仪器公司);Sigma高速离心机,超声震荡仪,超纯水系统。

标准品:5-羟色胺盐酸盐( 5-hydroxytryptamine hydrochloride, 5-HT)购自Alfa Aesar公司、肾上腺素(epinephrine, E) 购自中国生物制药公司、重酒石酸酸去甲肾上腺素(noradrenaline bitartrate, NE)、多巴胺盐酸盐(dopaminehy drochloride, DA) 、内标(IS)3,4-二羟苄胺溴酸盐(3,4-dihydroxybenzylamine, DHBA)、5羟吲哚乙酸(5’-hydroxyindile acetic acid, 5-HAA)均购自Sigma公司。乙腈、甲醇(天津市化学试剂批发公司),三氯乙酸(天津市风船化学试剂公司),庚烷磺酸钠(天津市光复精细化工研究所),磷酸二氢钾,乙二胺四乙酸钠(EDTA,天津市光复科技公司)柠檬酸,柠檬酸钠,氢氧化钠,均为色谱纯和分析纯试剂。使用超纯水。

2.2 实验方法

采集甲状腺减退病人空腹静脉血5 ml,室温静置2 h后875g离心分离血浆,置于-80 °C低温冰箱保存。取冷冻血浆于4℃冰箱解冻,待解冻后精确吸取血浆500μL,加入10μL1μg/mL IS,涡旋混匀 30s,再加入30%三氯乙酸80μL,涡旋混匀 1min,以12000r/min离心5min,取上清液,以0.22μm滤膜过滤,过滤液直接进样,进样量均为50μl。

精密称取NE、E、DA、5-HT、5-HAA以及IS 各1mg,溶解于0.1mg/L的盐酸中,配制成1mg/ml的标准品储备液,4°C避光保存。临用前使用超纯水稀释成1μg/ml的标准品混合工作液。

流动相配制:V(0.035mol/L柠檬酸,0.045mol/L磷酸二氢钠,0.25mmol/L乙二胺四乙酸二钠,0.002mol/L庚烷磺酸钠):V(乙腈)=95:5,采用氢氧化钠调节PH=4.5,经0.45μm滤膜过滤并超生脱气后使用,流速为1ml/min,温度为35°C,电化学检测器玻碳电极为工作电极,Ag/Agcl为参比电极,设定电压为+0.65V。

3 结果与讨论

3.1色谱图:图1为标准品在上述色谱条件下的分离色谱图,由图可见5种神经递质在该实验条件下都能得到较好分离,并且本实验中测定的生物样品中的单胺类神经递质也能得到较好的分离。

注:NE:去甲肾上腺素;E:肾上腺素;IS:内标,DA:多巴胺,5-HAA:5羟吲哚乙酸;5-HT:5-羟色胺

1 标准色谱图

3.2标准工作曲线:采用超纯水稀释1μg/ml标准品混合工作液,取适量加入到空白血浆中配制成浓度为1、10、50、100、200ng/ml标准品溶液,进样50μl,在以上色谱条件下进行测定,以峰面积为纵坐标(Y),浓度为横坐标(X),计算其回归方程,并以信噪比3 ∶1 ( S / N=3 ) 时样品浓度为该条件下的检测限。见表1。

1 5种神经递质的标准曲线

 

神经递质

回归方程

R2

线性范围(ng/ml)

检测限(ng/ml)

NE

y=0.0157x-0.0155

0.9994

1~200

0.2

E

y=0.0248x-0.0372

0.9987

1~200

0.1

DA

y=0.0474x-0.127

0.9977

1~200

0.8

5-HT

y=0.094x-0.2439

0.9987

1~200

0.5

5-HAA

y=0.0106x-0.005

0.9987

1~200

0.5

 

3.3精密度:精密吸取由标准品混合工作液配制的浓度为10、50、100ng/ml的标准品溶液,按上述色谱条件对每个浓度在同一天内连续测定5次,连续测定5天。测得各标准品溶液的峰面积(Y),计算其各自的日间RSD以及日内RSD值。见表2.

2 六种标准品的日间精密度和日内精密度

 

神经递质

浓度

(ng/ml)

峰面积

 

日间差异

RSD (%)

峰面积

 

日内差异

RSD(%)

NE

10

773234±7856

1.01

777234±3387

0.43

50

3840743±98186

2.6

3760742±33301

0.89

100

8046557±117710

1.5

8094815±74337

0.92

E

10

5311477±111978

2.1

5351477±46871

0.88

50

6893194±91639

1.3

6871194±37681

0.55

100

14326644±221154

1.5

14278075±42550

0.30

IS

10

3928481±60518

1.5

3868481±27854

0.72

50

19440929±301624

1.6

19120929±38648

0.20

100

37638218±685470

1.8

37510744±19277

0.51

DA

10

1810505±32737

1.8

1790505±12258

0.68

50

9772883±147095

1.5

9752883±25584

0.26

100

19958564±564233

2.8

19953101±23094

0.12

5-HT

10

2869530±82790

2.9

2849530±20420

0.72

50

16715756±471704

2.8

16435756±44275

0.27

100

36672362±825245

2.3

36049067±407545

1.1

5-HAA

10

1313612±26245

2.0

1281612±12759

0.99

50

6699105±145877

2.2

6681761±13280

0.20

100

1347806±6319278

2.4

13516492±22680

0.17

 

3.4准确度:将处理后的样品,分成两份,一份作为本底量,另外一份加入5ng的混合标准品溶液,分别测定计算5种神经递质的加标回收率(表3)。

3 5种神经递质的加标回收率

 

测定组分

样品含量(ng)

测得总量(ng)

回收率(%)

平均回收率(%)

RSD(%)

NE

1.59

6.25

93.1

102.72

7.11

0.88

5.73

96.99

0.95

6.44

109.8

1.5

6.9

108.12

1.12

6.4

105.63

E

1.41

6.08

93.45

95.23

3.84

0.9

5.71

96.18

1.6

6.26

93.21

1.93

6.54

92.13

1.95

7.01

101.2

DA

0

4.57

91.44

94.08

8.44

0

4.6

91.96

0

5.34

106.8

1.52

6.05

90/50

1.46

5.94

89.7

5-HAA

4.28

9.6

106.45

96.73

7.71

4.68

9.09

88.27

3.96

9.07

102.38

2.87

7.58

94.26

3.98

8.6

92.46

5-HT

27.93

32.61

93.59

97.13

8.18

31.38

36.17

95.79

37.93

43.17

104.76

63.16

67.48

86.37

54.32

59.57

105.14

 

 

3.5标准品的稳定性:用NE、E、IS、DA、5-HT、5-HAA标准品储备液稀释配制浓度为10μg/ml的混合溶液,避光保存于4℃冰箱,每次稀释成10ng/ml,于一周内每天测定一次,发现标准品在3天以后开始出现降解现象;而对测定过的10ng/ml 24h后再次测定发现降解。

  1. 讨论

本实验中选用的是电化学检测器,因此要求流动相中必须有电解质存在来保证流动相具有一定的电导率,一般使用缓冲盐溶液。而单胺类神经递质的测定常用的缓冲盐溶液有:磷酸二氢钠、醋酸钠、柠檬酸钠三种。本实验采用了磷酸二氢钠和柠檬酸钠。此外,在以往的报道中流动相中都加入的少量的离子对试剂以改善分辨率,避免待测物质被色谱柱填充料表面残余硅羟基吸附[7],因此本实验流动相中加入了庚烷磺酸钠以及EDTA离子对试剂,如图1所示NE、E、DA、5-HT和5-HAA达到了基线分离,保留时间稳定,重复性良好。

由于物质结构的影响,在碱性条件下,单胺类神经递质上酚羟基的氢原子和结构式中的羧基容易发生反应,影响其稳定性。本实验过程中发现5-HAA受PH的影响较大,在PH大于4.5达到6时,5-HAA的特征峰不能与基线分离。因此我们选择在酸性条件下对其进行分析,采用PH=4.5各物质峰形美观,分离效果较好,七种物质都能与基线分离。

本实验从系统内压力和基线稳定的角度出发,最终选择的流速为1ml/min。通过多次的实验证明,随着乙腈体积分数的增加,各物质的保留时间也相对缩短,反之增加。本实验中发现,在乙腈体积分数为5.5%时,DA和5-HAA保留时间非常接近,会出现峰形的重叠;调整乙腈体积分数为4.5%以后则各物质的保留时间延长,5-HT的保留时间达到了60分钟以上,一次分析的时间较长。综合考虑,最后采用的乙腈体积分数5%为最佳色谱条件。

在确定了各项实验条件下,对血浆样品的前期处理也直接影响到各物质的分离效果和系统的稳定。由于人的血浆中蛋白含量很高,在直接离心0.22μm滤膜滤过的情况下,过量的蛋白会堵塞柱子,因此需采用蛋白质沉淀试剂,且蛋白质沉淀试剂浓度的选择也是非常关键。常用的蛋白质沉淀试剂有高氯酸和三氯乙酸,文献报道有采用10%三氯乙酸、0.4mol/L的高氯酸等[8],本实验采用了10%高氯酸和30%三氯乙酸,发现三氯乙酸蛋白沉淀的效果较好,因此选择三氯乙酸蛋白质沉淀剂,并且在实验过程中我们发现浓度的选择与试剂的纯度有很大的关联,而纯度的变化受存放时间的影响较大。

 

参考文献

  1. 邹冈. 基础神经药理学, 北京科学出版社, 1999.
  2. 肖建英, 刘用璋, 陈淑英, 朱燕凌, 高淑贤, 李红. 甲状腺功能低下大鼠中枢5-HT对TSH分泌的影响. 中国地方病学杂志, 2000,19(4): 264-265.
  3. amara Stipcevic, Sanja Kusacic-Kuna, Martina Dezeljin, Damir Dodig, Mirko Korsic, Nela Pivac, Dorotea Muck-Seler. Platelet Serotonin Concentration and Monoamine Oxidase Activity in Hypothyroid Patients. Horm Res, 2009, 71:207–212.
  4. Perry M, Li Q, Kennedy RT. Review of recent advances in analytical techniques for the determination of neurotransmitters. Anal Chim Acta. 2009, 19, 653(1):1-22.
  5. 侯经国, 刘慧玲, 何天稀, 王柱命, 毛学峰, 杜新贞, 邓华陵, 高锦章. 高效液相色谱-电化学检测法研究针刺对家兔血浆及脑组织中单胺类神经递质的影响. 2002, 20(2): 140-143.
  6. 魏丽丽, 陈虹, 钟明, 杜娟, 刘斐, 刘春阳. 高效液相色谱-电化学法测定大鼠纹状体细胞外液中单胺类神经递质含量. 药物分析杂志, 2011, 31(3): 467-470.
  7. 鲁燕侠, 崔佳, 蔺兴遥, 逯振宇. RP-HPLC-荧光检测法测定小鼠脑组织中5种神经递质的含量. 解放军药学学报,2003, 19(4): 262-264.
  8. Lakshmana MK, Raju TR. An isocratic assay for norepinephrine, dopamine, and 5-hydroxytryptamine using their native fluorescence by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection in discrete brain areas of rat. Anal Biochem. 1997, 246(2): 166-70.

 

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