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高效液相色谱法同时测定血浆中的S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸

赵世晶 赛娜 任大林 徐蓓 刘川 黄国伟1

天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生系,天津,300070

    摘要:目的 建立同时测定血浆中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的高效液相色谱分析方法,并对正常人血浆中的含量进行测定。方法 样品用400g/L三氯乙酸处理,离心取上清液过膜,以50mmol/LNaH2PO4缓冲液(pH 4.38)、庚烷磺酸钠和甲醇为流动相,选用Venusil MP-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱进行色谱分离,流速为1.0mL/min,柱温30℃,紫外检测波长254nm。结果 SAM和SAH在相应检测浓度范围内与其响应值呈良好的线性关系(r=1);方法回收率在94.14~104.50%,相对标准偏差在1.00~8.10%。正常人血浆中SAM、SAH的含量分别为0.03~0.08mg/L、0.004~0.01mg/L。结论 该方法用于血浆中SAM和SAH的检测简便快速,准确可靠。

关键词:高效液相色谱法 SAM SAH 血浆

 

1  引  言

    S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)是一种生物化学上的甲基供体,是蛋氨酸在ATP的参与下由蛋氨酸腺苷转移酶催化形成的,同时,SAM在甲基转移酶的作用下脱去甲基形成S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH),最终SAH水解脱去腺苷转变为同型半胱氨酸[1]。SAM和SAH广泛存在于各种生物体内,作为重要的生理活性物质,它们参与机体代谢的甲基化,并与包括基因调控、荷尔蒙活性、神经传导发育和解毒在内的众多关键的身体机能密切相关。因此,它们表现出广泛和多样的治疗作用,对肝功能紊乱、抑郁症、关节炎等均有较好的疗效[2-4],并且是阿尔茨海默病(AD)[5]、帕金森病(PD)[6]、系统性红斑狼疮[7]、癌症[8-9]等很多疾病的重要指标。

目前,国内外对SAM、SAH的研究主要集中于SAM的检测,而对于同时检测SAM、SAH的报道较少。本研究建立同时测定SAM、SAH含量的高效液相色谱分析法,并对正常人血浆中SAM、SAH的含量进行测定。该方法线性范围宽,灵敏度高,样品处理简单,结果重现性好。

 

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

高效液相色谱仪配紫外检测器(美国Waters公司);Seven Easy S20 pH计(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);BSA224S电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);1-14型离心机(美国Sigma公司);KQ-250E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

SAM和SAH购自美国Sigma公司,纯度均 >99%;HCl、H3PO4为优级醇,购自天津博迪化工股份有限公司;NaH2PO4、庚烷磺酸钠、甲醇、三氯乙酸为色谱纯,购自天津市大茂化学试剂厂;实验用水均为重蒸水。

2.2 实验方法

 

2.2.1 标准溶液

分别准确称取SAM、SAH标准品各1mg,溶解于1mL 10-4HCl溶液中,即为1mg/mL标准溶液,-80℃保存。

2.2.2 样品采集与处理

样品采集 空腹取静脉血2mL,2%EDTA抗凝,立即4℃分离血浆(3000r×15min),-80℃保存。

样品处理 提取200μL血浆置于1.5mL离心管中,加入400g/L三氯乙酸40μL,冰上静置30min,以14000r/min离心20min,取上清180μL,用0.22μm针头过滤器过滤,进样分析。

2.2.3 色谱条件

色谱柱:Venusil MP-C18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:50mmol/LNaH2PO4缓冲液(pH 4.38)、庚烷磺酸钠和甲醇;流速:1.0mL/min;柱温:30℃;紫外检测波长:254nm;进样量:30μL。

3 结果与讨论

3.1 实验条件的优化

3.1.1 流动相的选择 选择NaH2PO4缓冲液和甲醇,NaH2PO4缓冲液、庚烷磺酸钠和甲醇,甲酸铵缓冲液作为流动相分别对样品中SAM、SAH进行分离。实验结果显示,以NaH2PO4缓冲液、庚烷磺酸钠和甲醇作为流动相时,SAM、SAH分离较好,其色谱峰的峰形优于其它流动相的峰形,且无拖尾现象。

3.1.2 流动相浓度的选择 比较不同浓度(5、8、10、15mmol/L)庚烷磺酸钠、NaH2PO4缓冲液和甲醇对SAM、SAH分离效果的影响。结果显示,标准品和样品在各种浓度下均可达到完全分离,且峰形、峰面积无差别。本实验选择适中浓度10mmol/L庚烷磺酸钠、NaH2PO4缓冲液和甲醇作为流动相。

3.1.3 最佳流动相配比的选择 流动相的甲醇含量对SAM、SAH的分离、出峰时间及先后顺序影响很大,分别试验了含有10%、15%、20%、25%(V/V)甲醇的庚烷磺酸钠、NaH2PO4缓冲液作为流动相,比较其保留时间并探讨其色谱情况。由实验结果可知,以NaH2PO4缓冲液、庚烷磺酸钠和20%(V/V)甲醇溶液作为流动相时,SAM、SAH能在较短时间内全部出峰,并且分离完全,出峰顺序依次为SAH、SAM。

3.1.4 流动相pH值的选择 不同的色谱柱,流动相应选择不同的pH值以达到最佳分离。配制不同pH值的NaH2PO4缓冲液、庚烷磺酸钠和甲醇溶液,加入H3PO4调节流动相的pH分别为3.88、4.38、4.88,观察SAM、SAH的分离情况,在pH为4.38的情况下,分离效果最好,峰形对称并且保留时间短。

3.2 色谱结果

按上述条件将仪器调试好,然后将标准品混合液和人血浆制备液进行HPLC检测,其色谱图见图1。SAH、SAM出峰的保留时间分别为7.1min、12.6min。

 

图1 SAH、SAM标准品(a)和样品(b)的色谱图

3.3 线性范围和检出限

   按1.4色谱条件测定SAM、SAH的混合标准溶液系列。得峰面积(Y)与浓度(X)的回归方程、相关系数及线性范围。按3倍信噪比计算检出限(LOD),10倍信噪比计算定量限(LOQ),结果见表1。

表 1  线性试验结果及检出限、定量限

 

组分

回归方程

线性范围

相关系数

LOD

LOQ

SAM

Y=17735X-71.062

0.05-2.0

1

0.011

0.027

SAH

Y=68446X+171.86

0.05-2.0

1

0.001

0.003

3.4 精密度和回收率

取混合血浆15份分样品组和4个加标组,分别加入不同浓度的SAM、SAH混合标准溶液,按前述方法进行测定,结果见表2,得SAM、SAH的平均加标回收率为94.14~104.50%,相对标准偏差(RSD)为1.00~8.10%。

表 2  SAM、 SAH的平均加标回收率

 

 

加标量1mg/L

加标量2mg/L

加标量4mg/L

加标量8mg/L

平均回收率(%)

RSD/%

平均回收率(%)

RSD/%

平均回收率(%)

RSD/%

平均回收率(%)

RSD/%

SAM

94.14

6.33

104.48

6.75

99.29

3.15

100.69

1.67

SAH

97.14

6.86

104.50

6.73

102.44

8.10

100.16

1.00

3.5 样品测定

分别测定了30例正常人空腹血浆中SAM、SAH的水平,其结果分别为0.03~0.08mg/L、0.004~0.01mg/L,与文献[10]报道一致。同时,随机取3份血浆对其中SAM、SAH的含量室温下随放置时间的变化进行研究,连续测定5天,结果显示SAM、SAH的含量基本没有变化。

3.6  结论

本研究通过选择并优化色谱条件,建立了能在较短时间内同时检测血浆中SAM、SAH的方法,为癌症、年龄相关性疾病、类风湿等多种疾病提供参考。该方法灵敏度高,选择性强,简便快速,结果准确可靠。

本研究发现SAM极易分解或降解,故将SAM碘化盐,SAM盐酸盐以及SAM对甲苯磺酸硫酸盐进行对比,结果显示SAM对甲苯磺酸硫酸盐最稳定,色谱峰分离效果最好,无杂峰干扰,且响应强度好,所以最后选用其作为SAM标准品进行实验。

参考文献

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